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    實時熒光定量PCR應用及結(jié)果分析--相對定量和絕對定量

    發(fā)布時間: 2025-03-07  點擊次數(shù): 41次

    第三章:實時熒光定量 PCR 的應用

    一、相對定量

    測定不同樣品中基因表達量的相對值。


    內(nèi)參基因的選擇

    (1)始終選擇表達充沛、均一的基因做為內(nèi)參基因;

    (2)不要盲目選擇常用的內(nèi)參基因;

    (3)常用內(nèi)參基因:GAPDH,Actin,Tublin。


    內(nèi)參基因的選擇至關重要,決定結(jié)果的有效性

    實時熒光定量PCR應用及結(jié)果分析--相對定量和絕對定量

    加入內(nèi)參基因后:

    實時熒光定量PCR應用及結(jié)果分析--相對定量和絕對定量

    結(jié)果計算

    實時熒光定量PCR應用及結(jié)果分析--相對定量和絕對定量

    二、絕對定量

    根據(jù)標準品,測定樣品中基因表達量的絕對值 ( 拷貝數(shù) )。

    標準品:具有明確拷貝數(shù)濃度的樣品

    A/ 克隆質(zhì)粒 B/ PCR 產(chǎn)物 C/ cDNA ( 擴增效率測定等用途可以使用,絕對定量不能使用 )

    實時熒光定量PCR應用及結(jié)果分析--相對定量和絕對定量

    拷貝數(shù)計算

    平均分子量(MW):

    dsDNA=( 堿基數(shù) ) x (660 道爾頓 / 堿基 )

    ssDNA=( 堿基數(shù) ) x (330 道爾頓 / 堿基 )

    ssRNA=( 堿基數(shù) ) x (340 道爾頓 / 堿基 )


    拷貝數(shù)計算公式 : (6.02 x 1023 拷貝數(shù) / 摩爾 ) x ( 濃度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml


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