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    ELISA實驗經(jīng)驗總結(jié)

    發(fā)布時間: 2024-04-18  點擊次數(shù): 472次

    前置知識

    ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,酶聯(lián)免疫吸附試驗)是一種常用的實驗技術(shù),用于檢測和定量分析樣品中特定抗原或抗體的存在。ELISA是基于免疫學(xué)原理的一種高靈敏度和高特異性的實驗方法。


    ELISA實驗通常包括以下步驟:


    1.涂覆:將待檢測的抗原或抗體溶液加入到微孔板(通常是96孔板)中,并在孔板表面上形成一層

    固定的抗原或抗體。這個過程被稱為涂覆。


    2.阻斷:為了防止非特異性結(jié)合,需要在涂覆后加入一種阻斷劑,例如牛血清蛋白(BSA)或牛奶粉,以覆蓋孔板上未被固定的表面。阻斷劑可以減少非特異性結(jié)合和降低背景信號。


    3.樣品加入:將待測樣品加入到微孔板中,樣品中的目標(biāo)抗原或抗體與固定在孔板上的抗體或抗原相互作用。


    4. 洗滌:通過反復(fù)洗滌孔板,去除未結(jié)合的物質(zhì),以減少背景信號


    5. 探針加入:加入與待測物體特異性結(jié)合的酶標(biāo)記二抗(例如辣根過氧化物酶-HRP)或酶標(biāo)記抗原,使其與樣品中的目標(biāo)物體結(jié)合。


    6. 洗滌:再次洗滌孔板,去除未結(jié)合的酶標(biāo)記物。


    7. 底物加入:加入一種底物,其與酶標(biāo)記物相互作用,產(chǎn)生可測量的信號。常用的底物是一種可被酶催化產(chǎn)生顏色或熒光的物質(zhì)。


    8. 反應(yīng)停止:通過加入一種停止劑,停止底物的反應(yīng),阻止信號進一步增加。


    9. 信號測量:使用光譜儀或熒光測量儀測量底物反應(yīng)產(chǎn)生的信號,根據(jù)信號的強度來確定樣品中目標(biāo)物體的濃度。


    ELISA是分子生物學(xué)、免疫學(xué)和細胞生物學(xué)研究中常用到的實驗操作之一,相信大家常常會有這樣那樣的實驗問題。


    以下是同學(xué)匯總關(guān)于ELISA實驗出現(xiàn)空白背景高的常見原因和處理方法的經(jīng)驗心得

    ELISA實驗經(jīng)驗總結(jié)

    問題:ELISA空白背景高的常見原因和處理方法

    通常陰性孔吸光光度值不會超過0.1。

    常見原因有以下這些:

    1)洗板不干凈

    解決方法:

    ①充分洗滌:如果洗板的時間不夠,會導(dǎo)致抗體殘留,陰性對照會顯色,嘗試延長洗板時間,增加洗板頻率,在洗液中添加表面活性劑Tween-20。

    在洗板時要保證每步都全部洗滌,充分拍板直至孔內(nèi)沒有明顯的殘留液體。

    ②避免交叉污染:棄去洗液和孵育的抗體時避免交叉污染,移液槍頭盡可能一次性使用,拍板的濾紙不要反復(fù)使用。

    2)顯色液變質(zhì)或者試劑過期

    解決方法:檢查試劑盒有效期,或使用新的試劑盒并按照說明書要求保存試劑盒。每次用剩下的顯色液最好不要回收,或者只回收洗凈的容器裝的顯色液。

    3)試劑稀釋有誤,檢測抗體/酶結(jié)合物工作液濃度過高

    解決方法:按照說明書推薦的稀釋倍數(shù)稀釋抗體。

    4)試劑盒組分未平衡

    解決方法:試劑盒每個組分都需要平衡至室溫后進行實驗。

    5)混用其他試劑盒試劑

    解決方法:保證使用試劑盒內(nèi)完整的一套試劑進行實驗,不同品牌及不同批次間的試劑可能存在不匹配現(xiàn)象,不同批號的試劑不要混用。

    6)蒸餾水受酶等污染

    解決方法:使用新鮮蒸餾水。

    7)培養(yǎng)箱溫度超過37℃或反應(yīng)時間過長

    解決方法:孵育時間過長、溫度過高可能會導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加,從而造成本底增高。檢查恒溫箱,確保孵育溫度穩(wěn)定在37℃,按照說明書的反應(yīng)時間進行孵育。

    8)酶標(biāo)板底部有污漬

    解決方法:在加完終止液之后,檢測之前,用75%乙醇浸潤的脫脂棉球擦拭酶標(biāo)板底部,確認(rèn)沒有污漬之后再檢測。

    9)洗液被污染

    解決方法:洗液現(xiàn)配現(xiàn)用,長期放置會析出,也可能會污染,導(dǎo)致背景偏高。

    10)包被的抗原被污染

    解決辦法:仔細回想操作過程,換新的抗原包被。

    11)封閉液、封閉時間、封閉液的濃度

    解決辦法:封閉液(BSA)可能會與抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。封閉液的濃度偏低、封閉時間過短導(dǎo)致部分封閉,抗體與酶標(biāo)板結(jié)合,可能也會導(dǎo)致背景偏高,因此可以適當(dāng)調(diào)整封閉液的濃度和時間以降低背景。

    12)抗體質(zhì)量差或選擇的抗體不合適

    解決辦法:抗體質(zhì)量不高,特異性不好可能會與封閉液(BSA)產(chǎn)生交叉反應(yīng),可以用0.8%明膠(明膠不含有血清成分)代替。

    若選擇多克隆抗體孵育,可能會與酶標(biāo)單抗產(chǎn)生交叉反應(yīng),導(dǎo)致背景增加,最好選用與酶標(biāo)單抗同種屬的多克隆抗體。

    13)酶標(biāo)儀設(shè)置參數(shù)有誤

    解決辦法:檢查酶標(biāo)儀設(shè)置的波長,不同波長下樣品的吸光光度值也會有很大的差別,按照說明書要求設(shè)置參數(shù)。

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