一、瓊脂糖凝膠的特點(diǎn)

核酸分子是兩性解離分子，在高于其等電點(diǎn)的電泳緩沖液中，其堿基不解離，而磷酸基團(tuán)全部解離，核酸分子因而帶負(fù)電荷，電泳時向正極遷移。

瓊脂糖主要從海洋植物瓊脂中提取而來并經(jīng)糖基化修飾，為一種聚合鏈線性分子，使用瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質(zhì)，發(fā)揮分子篩功能，使得大小和構(gòu)象不同的核酸分子的遷移率出現(xiàn)較大差異，從而達(dá)到分離的目的。

因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳，其優(yōu)點(diǎn)如下。

（1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。

（2）瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大（約占 98%~99%），近似自由電泳，樣品擴(kuò)散較自由電流，對樣品吸附極微， 因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。

（3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。

（4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。

二、DNA 的瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據(jù)它們的相對分子量質(zhì)量及分子構(gòu)型，同時與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。

1、核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系

（1）DNA分子的大小在凝膠中，DNA 片段遷移距離（遷移率）與堿基對的對數(shù)成反比，因此通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。

（2）瓊脂脂糖的濃度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。

瓊脂糖濃度與DNA分離范圍：

2、核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系

不同構(gòu)型 DNA 的移動速度次序為：供價閉環(huán) DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直線 DNA>開環(huán) 的雙鏈環(huán)狀 DNA。

當(dāng)瓊脂糖濃度太高時，環(huán)狀 DNA不能進(jìn)入膠中，相對遷移率為 0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈 DNA（剛性棒狀）則可以長軸方向前進(jìn)（Rm>0），由此可見，這三種構(gòu)型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時，也受到電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度等的影響。

三、瓊脂糖凝膠電泳實驗方法

1、選擇適合樣品預(yù)期片段大小的瓊脂糖凝膠濃度百分比。將瓊脂糖粉末與用于運(yùn)行凝膠的相同類型的緩沖液（TAE）結(jié)合起來，加熱使混合物融化，避免沸騰。

2、選擇所需尺寸的凝膠澆注模具和梳子，為樣品和marker提供足夠數(shù)量的孔，以及容納每個待裝樣品數(shù)量的孔容量。

3、膠凝固后，將凝膠放入電泳儀中，電泳液沒過凝膠，根據(jù)加入量的多少，決定混合多少ul的loding buffer，將樣液混合loding buffer用移液槍加入到凝膠中。

4、蓋上蓋子，確保電極和蓋子的方向正確，注意正負(fù)極， 打開電泳儀 ，設(shè)定凝膠運(yùn)行的時間和電壓，根據(jù)樣品大小確定運(yùn)行時間。

四、瓊脂糖凝膠電泳實驗技巧和注意事項

1、瓊脂糖凝膠溶液配制時總液體量不宜超過錐型瓶50%容量。

2、加熱時可以中途搖動搖動，防止瓊脂糖凝膠凝在錐形瓶底部。

3、注意不要損傷梳底部的凝膠。防止加樣時樣品漏出。

4、凝膠濃度越低，分辨的片段越大；凝膠濃度越高，分辨的片段越小。

5、使用紫外透射儀觀察，紫外光對DNA 分子有損傷作用，不可長時間照射。從膠上回收DNA時，應(yīng)盡量縮短光照時間以減少紫外光切割DNA。

6、紫光燈下觀察時應(yīng)戴上防護(hù)鏡，以免損傷眼睛。

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