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    DNA 復(fù)制需要哪些元素

    發(fā)布時(shí)間: 2023-06-28  點(diǎn)擊次數(shù): 1457次
    1) 需要脫氧核苷三磷酸:
    進(jìn)行 DNA 合成必須具備的 2 個(gè)關(guān)鍵底物之一,即 4 種脫氧核苷三磷酸——dGTP、dCTP、dATP、dTTP。通常商品化 PCR 酶會(huì)提供這 4 種脫氧核苷三磷酸的混合物 dNTP。 
    2) 需要引物-模板接頭:
    DNA 合成的第二個(gè)重要底物是一具有特定序列的雙鏈 DNA,稱為引物-模板接頭,即指 導(dǎo)互補(bǔ)脫氧核苷酸添加的單鏈 DNA 模板和與模板互補(bǔ)但比模板短的一小段序列。
    較長(zhǎng)的 DNA 鏈有一個(gè)與引物退火的區(qū)域和一個(gè)毗鄰的單鏈 DNA 區(qū),此區(qū)作為 DNA 合成的模板;較短的引物與較長(zhǎng)的 DNA 鏈退火,且必須有與模板單鏈 DNA 區(qū)毗鄰的游離 的 3’-OH,當(dāng)新核苷酸加入時(shí)引物的 3’-OH 端得以延伸。一般而言,引物-模板接頭的引物部分才是 DNA 合成的底物,而模板僅僅提供選擇哪種核苷酸進(jìn)行添加的必要信息。
    因此我們?cè)谠O(shè)置 PCR 反應(yīng)程序時(shí)第一步是高溫變性(一般會(huì)設(shè)置成 95℃變性),就是為了把雙鏈的模板變性成單鏈,第二步是降低溫度,是為了讓引物能互補(bǔ)匹配到單鏈模板上。

    3) 需要 DNA 聚合酶:
    DNA 聚合酶的三維結(jié)構(gòu)類似于一只右手。手掌域是催化活性位點(diǎn),可以催化任意 4 種脫氧核苷三磷酸的添加,這一區(qū)域結(jié)合 2 個(gè)二價(jià)金屬離子(通常是 Mg2+或 Zn2+)。其中一個(gè) 金屬離子降低 3’-OH 對(duì)其氫的親和力,這會(huì)產(chǎn)生一個(gè)準(zhǔn)備對(duì)引入 dNTP 上的 α-磷酸進(jìn)行親核 攻擊的 3’O-。第二個(gè)金屬離子與 dNTP 的 β-和 γ-磷酸負(fù)電荷協(xié)同作用,穩(wěn)定由引物和引入核苷酸連接在一起時(shí)所產(chǎn)生的焦磷酸。所以我們?cè)?PCR 時(shí),反應(yīng)體系里加入適量的 Mg2+是十分重要的,添加的量少導(dǎo)致 PCR 酶無法發(fā)揮最大活性,添加太多則降低酶反應(yīng)的特異性。
     
    DNA 聚合酶是一種延伸酶,其催化是快速的。DNA 合成的速度主要取決于 DNA 聚合酶 的延伸能力。在實(shí)際應(yīng)用中,一般的Taq酶的延伸速度大致是擴(kuò)增產(chǎn)物在2kb以內(nèi)是1kb/min。 擴(kuò)增產(chǎn)物超過2kb 的部分可以以500bp/min 來計(jì)算。比如擴(kuò)增2kb,延伸時(shí)間就設(shè)置成2min, 而擴(kuò)增 3kb,就可以把延伸時(shí)間設(shè)置成 4min。也有延伸能力更強(qiáng)的酶,那么延伸時(shí)間就按產(chǎn) 品說明書描述的來設(shè)置。


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