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    大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)——酶消化法

    發(fā)布時(shí)間: 2021-12-04  點(diǎn)擊次數(shù): 1178次

    材料與儀器

    SD大鼠
    纖連蛋白 Ⅳ型膠原 明膠 肝素鈉 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 青霉素 鏈霉素 NaHCO3 牛血清白蛋白 鼠尾膠 葡聚糖 DNA酶I D-Hanks'液 II型膠原酶
    低溫離心機(jī) 離心管 移液槍

    步驟


    一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
     
    1.  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
     
    每次實(shí)驗(yàn)采用10只2-3周齡SD大鼠,雌雄均可,體重40~60 g。

    2.  試劑
     
    纖連蛋白(fibronectin)、Ⅳ型膠原、鼠尾膠、葡聚糖(dextran,分子量100~200 kDa)和DNA酶I(DNase I)購(gòu)自Sigma公司;D-Hanks'液、10xPBS按配方自制;II型膠原酶購(gòu)自Worthington公司;明膠、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES購(gòu)自Amresco公司;Percoll 購(gòu)自Amersham Biosciences;DMEM(高糖)購(gòu)自GIBCO/BRL公司;肝素鈉、NaHCO3購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?;瘜W(xué)試劑公司;青、鏈霉素購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自PAA Laboratories;堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF),膠原酶/分散酶(collagenase/dispase)購(gòu)自Roche公司。
     
    3.   儀器
     
    低溫離心機(jī)(Centrifuge 5810 R,購(gòu)自Eppendorf;Himac CR 22F,購(gòu)自Hitachi)。
     
    4.  試劑配制
     
    (1)1 mg/ml鼠尾膠(用0.2%乙酸配制),1%明膠(用D-Hanks'液配制),1%II型膠原酶(用DMEM配制,用時(shí)稀釋成0.1%的濃度),1%膠原酶/分散酶(用DMEM配制,用時(shí)稀釋成0.1%),15%葡聚糖(用PBS配制),20% BSA(用DMEM配制,調(diào)pH值至7.4后用0.45 um濾膜過濾除菌,較難過濾),DNase I(用冷PBS配制成2 U/ul),以上試劑經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝保存于-20℃。

    (2)50%Percoll(配12 ml,需6 ml Percoll原液,0.67 ml 10xPBS,0.4 ml FBS,4.93 ml PBS);DMEM培養(yǎng)液(含4000 mg/L D-葡萄糖,4 mmol/L L-谷氨酰胺,添加3.7 g/L NaHCO3,20 mmol/L HEPES,肝素鈉 100 mg/L,青霉素 100 U/ml,鏈霉素 100 ug/ml),pH值調(diào)至7.4,過濾除菌后分裝保存于4 ℃,用時(shí)加入20% FBS及1 ng/ml bFGF。
     
    二、培養(yǎng)皿預(yù)處理
     
    1.  涂布3種不同的基質(zhì),培養(yǎng)前一天加入1 ml 1%明膠于35 mm塑料培養(yǎng)皿,置于37 ℃培養(yǎng)箱過夜,接種前用D-Hanks'液漂洗2次。

    2.  接種前4 h,加入鼠尾膠6~10 ug/cm2,在密閉的器皿里用氨氣熏5~10 min后,置于室溫1~2 h晾干后,用D-Hanks'液漂洗2次。

    3.  50 ul 0.1%纖連蛋白、50 ul 1 mg/ml Ⅳ 型膠原和400 ul雙蒸水混合后,加入到每個(gè)培養(yǎng)皿中涂布均勻后吸出,可涂布10個(gè)培養(yǎng)皿,置于37 ℃培養(yǎng)箱1~2 h晾干后,用D-Hanks'液漂洗2次。
     
    三、 腦微血管段的分離與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)
     
    1.  大鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中,打開顱腔后取出全腦置于盛有冷D-Hanks'液的玻璃培養(yǎng)皿中解剖去除小腦、間腦(包括海馬)。

    2.  隨后將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以吸除軟腦膜及腦膜大血管后置于新的含冷D-Hanks'液玻璃培養(yǎng)皿中,用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜,保留大腦皮質(zhì)。

    3.  用D-Hanks'液漂洗3次后,加入1 ml DMEM培養(yǎng)液,用虹膜剪將其剪碎成1 mm3大小,加入0.1%Ⅱ型膠原酶(含30 U/ml DNase I,1 ml/大腦)混勻后37 ℃水浴消化1.5 h。

    4.  離心(1 000 rpm,8 min,室溫),去上清液,加入20% BSA懸浮混勻后離心(1000 g,20 min,4 ℃)或加入15%葡聚糖懸浮混勻后離心(4 000 rpm,20 min,4 ℃),去除中上層神經(jīng)組織及大血管,保留底部沉淀。

    5.  加入2 ml 0.1%膠原酶/分散酶(含20 U/ml DNase I)懸浮混勻后37 ℃水浴消化1 h,離心(1 000 rpm,8 min,室溫),去上清液,加入2 ml DMEM培養(yǎng)液懸浮后鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12 ml 50% Percoll(25 000 g,60 min,4 ℃)。

    6.  離心(1 000 g,10 min,4 ℃),靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,吸出后用DMEM漂洗兩次(離心1 000 rpm,5 min,室溫),去上清液。

    7.  加入DMEM*培養(yǎng)液(含20% FBS,100 μg/ml肝素鈉)懸浮后接種于涂布基質(zhì)的35 mm一次性塑料培養(yǎng)皿(1.5 ml/培養(yǎng)皿,可接種1個(gè)培養(yǎng)皿/大腦),置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng),12~24 h后換液,并加入1 ng/ml bFGF,隨后隔天換液。
     
    四、鑒定方法
     
    形態(tài)學(xué)、Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)檢測(cè)。
     
    五、 結(jié)果
     
    1.   細(xì)胞形態(tài)觀察
     
    接種當(dāng)時(shí)可見由圓形的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的呈單枝狀或分枝狀的腦微血管段,并可見散在的單細(xì)胞及組織碎片(見圖1-1);培養(yǎng)12~24 h后可見培養(yǎng)的細(xì)胞從貼壁的微血管段周圍長(zhǎng)出,細(xì)胞呈短梭形,區(qū)域性單層生長(zhǎng),經(jīng)換液后微血管段的殘余部分不斷減少,成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞等雜細(xì)胞含量較少;隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),內(nèi)皮細(xì)胞不斷增殖,可見"漩渦"分布,大約5~7天細(xì)胞達(dá)到融合,短梭形的內(nèi)皮細(xì)胞占90%以上,但可見少量周細(xì)胞等雜細(xì)胞生長(zhǎng)于內(nèi)皮細(xì)胞單層表面或細(xì)胞克隆間隙(結(jié)果未顯示)。細(xì)胞生長(zhǎng)過程見圖1,細(xì)胞接種于纖連蛋白/Ⅳ型膠原涂布的培養(yǎng)皿。


     
    2.   涂布不同基質(zhì)的細(xì)胞生長(zhǎng)情況
     
    明膠及鼠尾膠涂布的培養(yǎng)皿微血管段貼壁時(shí)間較長(zhǎng),6 h時(shí)可見少量微血管段貼壁但無內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)出,12~24 h可見一些內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)出,24 h后腦微血管段*貼壁并有較多的內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)出,兩者無明顯差異(見圖2-1~4);纖連蛋白/Ⅳ型膠原涂布的培養(yǎng)皿培養(yǎng)后6 h即可見微血管段貼壁并有一些內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)出,12~24 h內(nèi)基本*貼壁并有較多的內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)出(見圖2-5,6)。


     
    3.  免疫組化鑒定
     
    Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化檢測(cè)可見培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿及核周有棕黃色著色,胞核呈空泡狀結(jié)構(gòu);對(duì)照染色為陰性。


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