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    qPCR實(shí)驗(yàn)為什么要制作熔解曲線?

    發(fā)布時(shí)間: 2021-10-11  點(diǎn)擊次數(shù): 4877次

    熒光DNA結(jié)合染料法的缺點(diǎn)是它們能在反應(yīng)中結(jié)合所有DNA雙鏈,包括在實(shí)時(shí)熒光PCR中產(chǎn)生的引物二聚體,和其他非特異性產(chǎn)物,引起大量的背景噪聲信號(hào)。


    這種噪聲會(huì)影響我們對(duì)靶基因產(chǎn)量的評(píng)估,甚至熒光強(qiáng)度和靶基因的起始量、全長(zhǎng)根本沒什么關(guān)系。


    因此,我們使用熒光DNA染料結(jié)合法時(shí),需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線的分析。通過對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物逐漸升溫,同時(shí)監(jiān)測(cè)每一步的熒光信號(hào)來制作熔解曲線。

    qPCR實(shí)驗(yàn)為什么要制作熔解曲線?.png

    熔解曲線的縱坐標(biāo)是熒光信號(hào)值,橫坐標(biāo)是溫度值。通過觀察產(chǎn)生的信號(hào)峰和對(duì)應(yīng)溫度,可以判斷產(chǎn)物狀態(tài)。


    理想情況下,熔解曲線應(yīng)該是單峰,峰值對(duì)應(yīng)溫度是特異性產(chǎn)物的退火溫度,這才能說明擴(kuò)增產(chǎn)物中特異性產(chǎn)物占比大。熒光DNA結(jié)合染料法的缺點(diǎn)是它們能在反應(yīng)中結(jié)合所有DNA雙鏈,包括在實(shí)時(shí)熒光PCR中產(chǎn)生的引物二聚體,和其他非特異性產(chǎn)物,引起大量的背景噪聲信號(hào)。

    qPCR實(shí)驗(yàn)為什么要制作熔解曲線?.png

    這種噪聲會(huì)影響我們對(duì)靶基因產(chǎn)量的評(píng)估,甚至熒光強(qiáng)度和靶基因的起始量、全長(zhǎng)根本沒什么關(guān)系。


    因此,我們使用熒光DNA染料結(jié)合法時(shí),需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線的分析。通過對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物逐漸升溫,同時(shí)監(jiān)測(cè)每一步的熒光信號(hào)來制作熔解曲線。


    熔解曲線的縱坐標(biāo)是熒光信號(hào)值,橫坐標(biāo)是溫度值。通過觀察產(chǎn)生的信號(hào)峰和對(duì)應(yīng)溫度,可以判斷產(chǎn)物狀態(tài)。


    理想情況下,熔解曲線應(yīng)該是單峰,峰值對(duì)應(yīng)溫度是特異性產(chǎn)物的退火溫度,這才能說明擴(kuò)增產(chǎn)物中特異性產(chǎn)物占比大。


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